大熊猫（A .melanoleuca）是我国特有的珍稀濒危动物。大熊猫处于濒危境地的主要原因在于个体数量少，分布地区狭窄而且割裂，长期被迫进行近亲繁殖（特别是圈养大熊猫），致使遗传多样性贫乏。通过对大熊猫遗传多样性及基因组结构的研究，可以估计现存大熊猫的遗传多样性贫乏程度，制定正确的大熊猫繁育计划，在最大程度上保持大熊猫的遗传多样性，避免严重近交可能带来的物种灭绝的恶果。当前对大熊猫基因组结构的研究甚少[ 12 ，13]，我们在已有的研究基础上[ 4， 5， 14]，对筛选鉴定的大熊猫微卫星序列的分析，以为大熊猫遗传多样性分析和基因组结构研究积累资料。
1材料与方宁波废气处理法1 .1材料大熊猫血液及组织样品由成都动物园提供。以E .coli XL1 blue为宿主菌，用于筛选和纯化重组质）为载体，用于微卫星序列的克隆。研究所用分子克隆工具酶购自美国Gib co BRL公司和德国BM公司非同位素标记试剂盒P ATP购自北京福瑞公司寡核苷酸由中科院上海细胞生物学研究所合成生物素标记的（CAC）由香港中文大学王晓飞博士惠赠。
1 .2小插入基因组文库的构建按照文献[ 8]和[ 10]进行大熊猫小插入基因组文库的构建。
1 .3微卫星DNA的筛选1 .3.1杂交膜的制备参照文献[ 10]的方法，将提取的重组质粒DNA斑点印迹到硝酸纤维素膜和尼龙膜上。
的同位素标记在1 .5 mL离心管后放沸水中变性5 min ，立即置冰浴上待用。
1 .3.3生物素标记的（CAC）探针斑点杂交斑点min .按ABC Kit说明书提供的程序进行检测。
探针斑点杂交斑点膜在预杂交液（0 .25 mol/L磷酸缓冲液/ 1交2 h后，加入50μL标记好的探针， 62℃杂交过SDS在64℃洗涤，检测到放射性活度值为10～20计数/s时， 20℃放射自显影。
1 .4微卫星的回证1 .4.1探针标记用随机引物法：在离心管内加即置冰浴上待用。
分别完全酶切约10μg基因组DNA ，将纯化的酶切产物Southern印迹到尼龙膜上，用αdCTP标记的微卫星探针进行Southern杂交（程序同1.
3 .3和1 .3.4中的斑点杂交），分析杂交图谱。
2结果与讨论2 .1微卫星的分离分离微卫星的方法主要有3种：（1）用末端标记的（CA）等寡核苷酸探针筛选大插入片段基因组文库，再通过微卫星探针杂交，从大插入片段基因组文库中筛选含重复序列的DNA片段，亚克隆，测序。该法需要多次杂交和亚克隆。（2）常规方法：用质粒载体构建小插入片段基因组文库，以微卫星探针杂交，分离重复DNA ，测序。获得预期微卫星的频率低。（3）结合PCR方法，从高度富集了微卫星的小插入片段基因组文库中分离重复DNA ，微卫星片段的分离频率高，但所需经费多，实验条件要求高。根据实际条件，我们采用修正的常规方法。
用识别4个碱基对的限制性内切酶HaeⅢ或AluⅠ完全酶切来自动物园圈养大熊猫不同个体的片段SmaⅠ完全酶切克隆载体pBS，脱磷酸化。用T4连接酶连接回收的DNA片段和线性化后脱磷酸化的pBS，将连接物转化宿主菌E .coli XL1 blue，共获得4 257个转化子，将转化子点种到含X Gal和氨苄青霉素（Amp）的LB平板上，通过蓝白筛选，提取白色菌落的质粒DNA ，经EcoRⅠ酶切、电泳，筛选出205个重组质粒，随机挑选13个重组质粒DNA ，再经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切、电泳，证实有不同大小的插入片段。将205个重组质粒斑点印迹到硝酸纤维素膜和尼龙膜上，分别用生物素标记的（CAC）和作探针进行斑点杂交，共应用与环境生物学报7卷序列片段大小碱基组成重复类型获得15个含微卫星插入的阳性斑点，其中（CAC）探针检测出5个阳性斑点，（CA）探针检测出10个。
2 .2微卫星的序列测定利用Sanger双脱氧核苷酸链终止法[ 11]，在斑点杂交所获得的15个阳性重组子中，测定了14个插入片段的序列。所测定的序列分别命名为GPMS 1～13（其中有两个为相同的重组子）。对其中8个DNA序列分析表明，最小的259 bp ，最大的881 bp ，平均大小2 .3微卫星序列的特征已有研究发现，微卫星的核心序列由1～8 bp重复单位组成，二核苷酸重复常见为（GT）（n =10～60），四核苷酸重复常见为（GATA）和n.这种结构与小卫星DNA类似，但重复单位普遍比小卫星DNA短。
用DNASIS 7 .0软件对上述8个序列进行分析，并通过Internet进入GenBank作同源搜索后，应用软件Bankit ，将序列存入GenBank ，取得登记号：由表1可见，8个序列中，AF076488含有（TG）9，均是典型的二核苷酸重复。AF076488中还的四核苷酸重复。从上表还可以看出，可能由于其他碱基的插入导致重复序列的中断。例TTT（GA）T ，可能是单核苷酸T的重复由于插入了A和G被打断。AF076491中可能是因为碱基置换而使单核苷酸G的重复不连续。此外，4个由（CAC）探针筛选的序列AF076486 ，CAC三核苷酸重复，原因有待进一步研究。
AF076486和AF076487序列中虽然没有完整的1～8 bp的串联重复序列，但却包含有与已知的微卫星序野猪的微卫星序列中相应片段的同源性高达98 .
因此，有可能这两个微卫星的串联重复序列本身并没有被克隆到，而克隆的仅为串联重复序列的侧翼序列。
这些序列的（G C）含量中， AF076491最高，达62 .5（表1），与此相应，该序列中除含有4个多G区外，还含有较大比例的特殊的富含GC的限制性内切酶识别位点（表2）。
2 .4微卫星序列的同源比较在测定的13个序列中，其中5个序列已进行了同源分析[ 12].对余下的8个序列进行类似的分析后，AF076492、AF076493）中同样含有来自大熊猫及其它熊类的运甲状腺素蛋白基因内含子1（transthyretin intron 1）的同源片段，并且同源部分从31 bp到155 bp不等，同源性也变异于72 到86 之间，这对了3期曹玫等：大熊猫基因组微卫星DNA的分离与序列分析解大熊猫和相关熊类动物的基因组结构以及它们之间的进化关系是有所帮助的。另外， AF076488和AF076491序列中也含有与人类基因组DNA同源的B2样重复序列的同源片段。
2 .5微卫星的回证为证实这些微卫星确实来自大熊猫基因组，我们分切的大熊猫基因组DNA进行Southern杂交，（2）和阳性克隆的斑点印迹进行斑点杂交，结果表明，这些微卫星序列确实来自大熊猫基因组。
微卫星高度的可变性，即丰富的多态性信息含量（PIC），主要体现在其可变的等位基因长度。这种可变性可能来源于复制过程中复制酶的滑动，也可能由不等价交换造成，还可能是在微卫星侧翼序列上插入或缺失引起重复数目改变的结果[ 3 ，7].我们所分离鉴定的微卫星的重复区的侧翼序列已清楚，可以根据这些侧翼序列，设计合适的引物，对不同圈养的大熊猫个体进行DNA分型（DNA typing），亲子鉴定，个体间遗传变异比较，为选择合适的交配体系提供科学依据。
直接利用PCR技术研究遗传多样性及群体结构，可避免费时、费力的反复DNA杂交，因而快速简便，所需DNA量少，特别是可采用非损伤方法取样，解决了珍稀濒危物种取材难的问题，对大熊猫的研究有重要的实用价值。
致谢感谢在国外实验室工作的陈建国教授、王小忠博士和香港中文大学的王晓飞博士，他们在百忙中帮助测定了DNA序列。
10 J.萨幕布鲁克， E.F.弗里奇， T .曼尼阿蒂斯。分子克隆实验指南。第二版。北京：科学出版社， 1989 12吴政安，曾维克，徐奇虹，李翔，王今朝，萧淑熙，刘维新，谢钟，叶掬群。1989.大熊猫高度重复序列DNA的Science Edition）（四川大学学报（自然科学版。细胞生物学与人类遗传学论文集））。1998， 35 ：275～281应用与环境生物学报7卷
