重复序列上下游两段序列与已知序列相对应的序列有较高的同源性，并具有一和等典型的M序列特征。
为验证此序列的功能，以一葡糖醛酸酶（一因）作报导基因构建了植物表达载体，通过农杆菌介导转化了烟草。
定量检测表明，由于此序列的存在，必基因的平均表达水平提高了倍，最高的单株可达倍。
上述结果表明，该具有序列的特征序列，并且具有增加转基因表达的功能。
关键词核基质结合区转基因植物一葡糖醛酸酶外源基因表达植物基因工程研究为培育作物优良新品种开辟了一条崭新的途径。
随着该学科的发展，许多具有重要经济价值的转基因作物开始进人实际应用阶段。
一个优秀的基因工程植物首先需要外源基因能够按照设计要求有效地进行表达然而，大量研究结果表明，外源基因在转基因植物中由于位置效应甲基化共抑制及反式失活等原因，导致在转录水平转录后水平等不同阶段发生基因失活现象。
因此，有效地提高外源基因表达的水平，克服外源基因失活现象对开展植物基因工程至关重要通过外源基因的定点插人改变外源基因碱基组成等策略可以部分解决外源基因失活问题然而，利用核基质结合区是近年发展起来的克服外源基因失活的一种最为有效的方法。
是真核生物染色质上的一段富的序列，通过与核基质相结合，使之间的染色质区域形成染色质环，每一个环为独立的结构单位和基因表达调控单位利用的这个特性，可以把M构建到外源基因的两侧，使它们在转基因植物的染色质中形成独立的区域，这样不但可以避免位置效应等因素对外源基因表达的影响，而且还可以提高外源基因在转化细胞中的稳定性和表达水平实验证明，序列的存在可以有效地降低葡糖醛酸酶（u基因在转基因植株当代和子代中表达的变化程度。
在外源基因不超过个拷贝数的情况下，的存在可以降低共抑制效应等人证明，在转基因杨树中烟草一收修改稿，国家自然科学基金重点资助项目批准号国家高技术计划基金资助项目批准号一和国家转基因植物研究与产业化开发专项基金资助项目批准号一联系人，一沮第期李旭刚等豌豆核基质结合区的分离及其在转基因烟草中的功能分析序列的存在可使表达量明显提高，并且转基因杨树中的效果好于转基因烟草中的。
本研究从豌豆基因组中分离出一段序列其具有M序列的特征，为验证这个序列在转基因植物中是否具有的生物学功能，我们将其构建在植物表达载体中，并用于转化烟草。
材料与方法材料大肠杆菌人人i根农杆菌吞晌质粒）和为本实验室保存。
质粒叭质粒一为本实验室构建。
烟草品种为本实验室保存。
豌豆沪）品种灰豌豆购自中国农业科学院蔬菜研究所。
限制性内切酶修饰酶购自华美公司和六合通公司。
高保真酶购自公司。
同位素一，购自亚辉生物工程公司。
植物基因组的制备按照文献利用改进的方法从萌发的豌豆幼苗叶片中提取基因组序列的扩增及其产物的克隆反应条件依高保真Ta酶扩增系统说明书进行。
变性温度为退火温度为延伸温度为循环后保依文献设计Pl，序列为引物，端引物‘一一端引物’一一产物经聚合酶大片酶补平后，用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收扩增片段，并插人到克隆载体的口单酶解位点。
按照一公司电激仪的操作程序，采用电激法转化在含有一的氨节青霉素选择培养基上挑选白色菌落，得到重组质粒序列分析按照公司一方法由上海皓嘉生物技术公司测序。
植物表达载体构建质粒经双酶切获得序列，酶补平后，插人双元植物表达系统中一质粒的尸m单酶切位点，获得重组质粒尸m.
龙双酶切质粒获得含有一即一的片段，插人到质粒的位点万位点用补平获得重组质粒一为使两段序列成顺式重复，双酶切一位点用补平获得含有一即一的片段，插人到的tl双酶切位点肠位点补平），获得质粒一双酶切一卜）（位点用聚合酶削平获得一即一片段，此片段与口双酶切质粒聚合酶削位点获得的大片段连接，产生质粒载体一厂E双酶切质粒PS获得含有启动子的一的结构，分别插人到一及一的胶位点，获得植物表达载体一（图））和一（图中国科学辑第卜即d月一令二翻目。曰目卜一仁一图植物表达载体结构示意图一盯一其中，一示启动子即示植物选择标记新霉素磷酸转移酶基因溯示以基因一示胭脂碱合成酶基因终止子示一左右边界烟草转化及再生植株的筛选植物表达载体一与空载体一通过电激法转化到农杆菌参照一说明书利用改良的叶盘法转化烟草品种获得的卡那霉素抗性再生苗在生根培养基上生根，最终将根系发育完全的卡那霉素抗性植株转移至温室生长。
活性定t测定活性定量测定按的方法进行，测定成熟的转基因烟草叶片中的活性。
取植物材料，加林L提取缓冲液在中研磨成匀浆，离心后吸取林上清，加底物一甲基伞形一葡糖昔酸（一）混匀，保用一日立型荧光分光光度计测定扭总蛋白质含量按标准方法测定活性以一甲基伞形酮一的纳摩尔数与总蛋白质含量及时间的比值蛋白表示。
杂交分析采用改进的法提取烟草基因组取此加人内切酶37温浴过夜，的琼脂糖电泳。
采用碱法转移到十）尼龙膜。
预杂交，杂交按照等人方法。
利用同位素一依随机引物标记试剂盒进行探针标记。
杂交膜用洗去背景后，压射线片放射自显影。
结果序列的克隆和序列的分析以豌豆苗基因组为模板，根据等人发表的序列设计了引通过方法扩增M序列。
扩增产物克隆到质粒中并测序，结果表明，克隆片段长含有在M序列中常见的几个短的序列，如一序列及拓扑异构酶识别切割序列但是与发表的序列相比我们分离的序列中部缺失了帅长的重复序列，中部剩余序列见图画双线部分。
重复序列上下游两段序列与已知序列相对应的序列同源性分别为第期李旭刚等豌豆核基质结合区的分离及其在转基因烟草中的功能分析0孙LT引义汀从应亚亚网邓T吞仆下一伽寒呜心吞图序列分析内匕内月空框内序列示一下画线示序列，阴影示拓扑异构酶识别切割序列，黑体示引物序列，中部剩余序列画双线表示植物表达载体的构建及烟草转化为验证该序列是否具有M的功能，以基因作报导基因，在烟草中分析其功能活性。
本实验以动子控制的基因构建了植物表达载体一图按照文献川报道，两个成顺式重复的效果比反式重复的效果好。
因此，我们构建的植物表达载体中基因两侧的M序列成顺式重复排列。
以不含序列的植物表达载体一为实验对照（图此载体只含有5S启动子控制的基因。
一为空载体（图除不含基因外，其他结构与一相同，以其作为植物转化的负对照。
转基因植株的活性测定取生长在温室中的充分展开的烟草叶片，参照文献方法，对转基因烟草植株定量检测。
为减少误差，每株烟草取材部位是一致的，均为距顶端第片展开的叶片。
一和一转化的烟草各检测了株，一转化的烟草和非转化烟草各株。
结果发现，在一转化群体中，单株表达水平普遍比一转化植株的活性高（图平均高倍（图最高可达倍，达一2.
研蛋白一转化烟草的表达活性与非转化烟草中国科学辑第卷相同，均为本底水平图丫三日田图一l切日。
匀芝一。
昌碧收一毛田酬一一助日匀一苍。
昌担阳S口碧收S二口一图转基因烟草植株活性检测转基因植株叶片活性测定荧光值的激发波长为发射波长为和图中每个柱形图代表一个独立的转基因植株。
一转基因植株单株活性一转基因植株单株活性为定量检测获得的平均活性，一分别为相应载体转化获得的转基因植株，示未转化阴性对照植株中国科学辑第列的功能，本研究将其构建在载体的一结构域中，形成植物表达载体一图通过农杆菌介导转化烟草，对获得的转基因烟草植株进行定量，一和一转化的烟草各检测了株。
活性检测表明，含有序列的转基因植株活性总体比不带序列的转基因植株的活性高（图平均可以使活性水平提高倍在克服基因失活方面，载体一的转基因群体中无活性的植株数目明显比一转基因群体中少和表明在转基因烟草中不但可以提高基因的表达水平，而且可以克服基因失活。
但是在转基因植物中，外源基因的表达水平不仅受位置效应的影响，还受甲基化重复序列诱导的基因失活等因素的影响，因此，序列只能在一定程度上稳定基因表达水平，克服基因失活。
这也是为什么有些一转基因植株的活性比一转基因植株低的原因。
进一步对转基因植株作分子水平检测，杂交结果显示转基因植株整合的赵基因拷贝数多少不一（图4），尽管如此从统计学角度考虑，提高外源基因的表达显而易见。
目前，我们正对转基因植株做深人研究，希望了解M影响基因表达是否依赖基因的拷贝数。
综上所述，本研究从豌豆基因组中分离出的特异序列不但在结构上具有特征，同时也具有的生物学功能。
因此，可以证明此序列具有序列的特征序列，同时在转基因植物中还可以提高外源基因的表达水平。
与核基质的相互作用具有保守性。
植物中，不同物种的和核基质之间可相互作用，如大豆凝集素和热激蛋白基因可以和烟草的核基质结合不同种属如植物与动物之间的M和核基质可以互相结合，这充分说明M一相互作用是高度保守的本研究结果显示来源于豌豆的M可以在烟草中提高外源基因的表达水平，表明与烟草核基质可以相互作用，暗示在其他作物中也应具有活性，这对培育外源基因稳定高效表达的转基因工程农作物具有重要意义。
参考文献李旭刚，谢迎秋，朱祯。
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生物技术通报，一刘春明，朱祯，周兆斓，等。
更豆胰蛋白酶抑制剂抗虫转基因烟草的获得。
科学通报，一工汰第期李旭刚等豌豆核基质结合区的分离及其在转基因烟草中的功能分析巨应一日一
