1引言21世纪是生物学世纪，更是分子生物学时代。近年来，水稻基因的研究主要集中在分离和克隆有经济价值的功能基因，利用分子生物学技术手段，越来越多的水稻功能基因完成或正在克隆，目前，分离和克隆基因的途径主要有正向遗传学途径和反向遗传学途径。正向遗传学途径是指通过获得目的基因表达产物（如特异蛋白质和mRNA）来分离和克隆基因而反向遗传学途径是指通过基因定位或基因突变来实现。一般情况下，一种植物基因的表达产物是未知的，要获得未知基因的表达产物难度比较大，因此，走正向遗传学途径困难大，迄今为止还未见通过此途径克隆到植物基因而反向遗传学则显示出广阔的应用前景，通过基因定位途径，已克隆到数十个植物功能基因。基因定位主要是利用分子标记构建高密度连锁遗传图谱，并将与分子标记紧密连锁的目标基因定位到染色体上。最后通过分子标记分离并克隆该基因，可见，分子标记技术是分离和克隆基因的关键环节，本文主要概述了几种常用分子标记技术的基本原理、特点及水稻功能基因的定位和克隆领域的研究进展。
2分子标记技术的基本原理及特点分子标记是一个特异的DNA片段或能够检测的等位基因。与最初的形态标记、细胞学标记和生化标记相比有许多优越之处，如分子标记共显性，稳定性好，可靠等。分子标记已广泛应用到基因定位与克隆、作物遗传育种、动植物系统学、物种鉴定及疾病诊断等领域中。到目前为止，已有几十种技术可用于分子标记的筛选（）。本文介绍RAPD、RFLP及AFLP三种最常用的分子标记技术的基本原理及特点。
限制性内切酶酶切片段长度多态性标记随机扩增多态性DNA扩增的限制性内切酶片段长度多态性表达序列标签简单重复序列序列特异扩增区域测定序列标签位点简单顺序长度多态性微卫星DNA（重复单位2） 5bp）数量可变串联重复RAPD的全名是随机扩增多态性DNA （ Random起来的一种DNA多态性检测技术，由Williams和Welsh于1990年发现的，其原理是：它以一系列不同的，以少数碱基组成的随机核苷酸序列作引物，对样本基因DNA进行PCR扩增，每个RAPD片段的产生要求在可增范围内存在与引物匹配的反向互补序列，引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间，碱基的缺失、插入或转换都能导致扩增片段的数目和长度的差异。最后，经琼脂糖凝胶电泳分离和EB染色来检测DNA片段的多态性。该技术的反应引物是随机排列的，且引物较短（一般10bp左右） ，这使得RAPD技术甚至可以在对物种没有任何分子生物学研究的情况下，对其进行DNA多态性生物学杂志分析。另外，该技术具有经济、简便且又迅速，因此很快广泛应用到生物研究的各个领域。
限制性片段长度多态性（ Restriction Fragment碱基序列差异的表现，它是指一个物种DNA被某种特定的限制性内切酶消化所产生的DNA片段长度的变异性。这种变异性是由于变种变异的产生或是由于单个碱基的突变所导致的限制性位点增加或消失，或是由于DNA序列发生插入、缺失、倒位、易位等变化所引起的结构重排所致。差异性片段经放射性同位素标记后进行电泳检测。RFLP分子标记具备共显性、丰富性、稳定性与无重复性等优点，这种技术在分子图谱构建及基因定位领域发挥了技术上的优势。目前，绝大部分已克隆或定位的植物基因利用了RFLP分子标记。
将RFLP与PCR相结合的一种技术。其基本原理是对基因组DNA限制性酶切片段的选择性扩增使用双链人工接头（ artificial adapter）与基因组DNA的酶切片段相连接作为扩增反应的模板，接头与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列作为引物的结合点根据基因组中被扩增DNA片段两端的序列设计或合成相应的引物，引物3端包含有选择碱基，其作用是延伸到酶切片段区，以保证那些能与选择碱基配对的限制性片段被扩增。扩增片段通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测。AFLP技术是结合了RFLP和PCR的优点，是作图效率最高的一种，可用于构建基因组的高密度连锁图谱，作为联系遗传图谱和物理图谱的一个桥梁。
3水稻基因的定位及克隆进展利用分子标记构建高密度的分子遗传图谱，并对目标基因定位，进一步克隆该基因，或利用连锁的分子标记进行辅助育种，是近来研究水稻基因的主要方向。定位及克隆基因的一般策略是： （ 1）构建完整的高密度分子图谱。提高分子标记密度和图谱精确性的方法是：将多种分子标记（如RAPD、RFLP、AFLP、EST等）结合起来构建图谱，密度及精确性都要比单独某种分子标记高得多也可将不同的分子连锁图谱整合来实现。（ 2）根据目标基因建立遗传分离群体。一般构建的分离群体有暂时性分离群体（ F2、F3、F4、BC群体、三交群体等）和永久性分离整体（重组近交系RIL、近等基因系NIL和加倍单倍体DH群体） ，研究者可根据具体实际情况来选择最合适的分离群体。（ 3）筛选分子标记，找到与目标基因紧密连锁的分子标记。（ 4）基因定位，利用分子图谱（遗传图谱或物理图谱）将目标基因定位在染色体特定位置。（ 5）构建基因文库并用与目标基因连锁的分子标记为探针进行筛库，获得含有目的基因区域的跨叠克隆群。（ 6）通过染色体步行、登陆、跳跃等技术获取含有目的基因的大片段，再进一步亚克隆得到小片段克隆。（ 7）通过遗传转化和功能互补验证，最终确定目标基因的碱基序列。这一策略在分离和克隆基因领域已获重大成功，已报道有几种与农作物经济性状密切相关的功能基因通过此途径获得克隆构建高密度分子图谱水稻第一张分子图谱由美国康乃尔大学Tankey实验室发表，该图谱有标记700多个，绝大部分为RFLP标记，有11个微卫星标记， 26个克隆基因和43个表型性状。陈洪等利用RAPD标记构建的水稻分子标记图谱有52个RAPD标记，覆盖基因组总长度为89814cM（ centimorgon） ，标记间的平均间距为1713cM.日本早在1991年发表水稻分子图谱[ 6]，并且进展速度很快，他们结合RAPD和RFLP技术构建的图谱有RAPD标记[ 7].日本和美国在构建水稻分子图谱时，积极合作，互相交换探针，将他们的分子图谱整合，获得更致密，更精细的图谱有水稻分子遗传图谱含有2275个标记，覆盖基因组的[ 9].构建物理图谱也是定位克隆技术的一个至关重要的环节，目前利用稀有切点内切酶结合PFGE技术已经成功用于植物基因组的大规模物理定位，从而可以确定连锁标记与目标基因间实际物理距离的大小。
构建水稻的物理图谱也为期不远。
基因的定位与克隆高密度分子图谱的构建为水稻的基因定位奠定了基础。水稻抗性基因、数量性状基因（ QTL）、恢复基因、不育基因、广亲和基因等基因的定位工作均取得一定进展。
其中水稻的抗病基因是研究得最为透彻的一类基因。在抗稻瘟病方面，朱立煌等用RAPD标记和RFLP标记结合群体分组法，从来自窄叶青8号和京系17的DH群体构建的抗病池和感病池中筛选到与稻瘟病抗性共分离的RAPD标记。用RFLP标记和两个独立的分离群体用近等基因系为研究材料，用800个RAPD进行多态性筛选，最终得到一个稳定性好，能重复的RAPD标记与抗病性基因共分离，该标记对应的扩增产物为b 1，相应基因Pi 5.
已发现水稻中的抗稻瘟病基因有22个， 15个位点，进行遗传学定位的基因主要有12个。它们是Pi） b ， Pi（中括号内为染色体编号）。在抗水稻白叶枯病方面， Ronald等利用近等基因系IRBB21与轮回亲本IR24杂交产生的F2群体对Xa21基因定位，利用RFLP标记和RAPD标记获得了三个与Xa21基因共分离的分子标记11号染色体上，与三个标记图距不超过cM.已被定（中括号内为染色体编号）。除此之外，近年来稻飞虱、稻叶蝉、瘿蚊病等抗性基因定位也有一定的进展。
影响水稻产量和稻米品质构成的性状绝大多数是数量性状，这些性状由QTL基因控制。在水稻中，一个数量性状往往由多个主效基因QTL和微效QT L控制，因而定位工作要复杂些。Ray等采用Co39（低温地适应品种）与Morobenekan（干旱地适应品种）杂交而获得的281个RI株系，对控制根穿透能力性状位点进行RFLP标记，确定出与穿透蜡层根数、总根数、根穿透指数与分蘖指数相连锁的QTL分别是14、9、6和4，证明水稻抗旱性状是微效多基因控制的数量性状。Wu P等采用生物学杂志来自于同一粳稻的两个品种为亲本的123个DH株系，以250mg/ L过量Fe2浓度与对照进行营养液栽培，选取叶片棕化和冠干重相对比率作为衡量Fe毒害程度的指标。定位出第一条染色体） RG345/ RG381和RG810/ RG331位点与叶片棕化指数有关。与水稻营养性数量性状的定位，能为数量性状遗传改良提供快速的辅助选择指标，通过分子标记辅助育种，有望加快水稻数量性状的遗传改良进程。另外，水稻的光温敏不育基因、育性恢复基因、广亲合基因等方面也作了大量的定位工作。李子银等对农垦58S/大黑矮生标记基因系F12组合组建可育集团和不育集团，并以亲本对照进行了RFLP、RAPD和双引物RAPD分析，结果第12染色的一个单拷贝标记G0与光敏不育基因连锁，二者的遗传发现了6个恢复基因的RAPD阳性标记，结合RFLP技术，定位了3个标记与Rf3基因连锁位于第1染色体上。
随着水稻的高密度分子标记图谱的构建及基因定位的迅速发展，分离和克隆水稻基因工作有突破性进展。
Wang等（ 1999）成功地再克隆了稻瘟病抗性基因Pi b，该基因包含核苷酸结合位点（ LRR）和富含亮氨酸的重复密连锁的3个RFLP标记，用这些标记筛选YAC文库之后得到了10个YAC克隆，其中的Y5中含有该基因。目前通过定位途径克隆到的基因均为抗性基因（见基因突变性状白叶枯病稻瘟病1998国际植物病理会议枯萎病4结束语水稻在我国是一种主要的粮食作物。早在六十年代，著名水稻专家袁隆平发明了杂交水稻，大大地提高了水稻的产量，带来了巨大的经济效益和社会效益。水稻已成为目前重点研究的作物之一，投入的研究力量在不断地加大，但近年来获得的突破性进展并不多，其原因是水稻的基础理论研究还远远跟不上应用研究，对实践生产中出现问题（两系法杂交稻育性反复，产量高的品种米质差，病虫害严重等）还不能从根本上解决。利用先进分子生物学技术手段深入研究水稻基因，获得更多的与目标基因紧密连锁的分子标记，从而克隆出目标基因还能实现分子标记辅助育种，加快性状的遗传改良进程，可望在水稻领域再一次实现历史性突破。
程式华1杂交水稻育种材料和方法研究的现状及发展趋势[ J]王泽立，戴景瑞，王斌1植物基因的图位克隆[ J] 1生物技术陈洪，朱立煌，徐吉臣，等1 RAPD标记构建水稻分子连锁图[ 10]朱立煌，徐吉臣，陈英，等1用分子标记定位一个未知的抗[ 12]曾千春，叶华智，朱祯，等1稻瘟病分子生物学研究进展[ J] [ 14]戳文学，朱立煌1水稻白叶枯病抗性基因的研究与分子育种[ 17]李子银，林兴华，谢岳峰，等1利用分子标记定位农垦58S的生物学杂志
